Lección 26. Medios de cultivo

Técnicas de cultivo microbiológico[1]

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

 

Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial éste debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuada, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

 

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

 

Figura 43. Cultivo de bacterias y aislamiento de colonias

 


 

Tomado de: http://www.telmeds.org/wp-content/themes/medpress/scripts/timthumb.php?zc=1&w=300&h=150&src=http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2009/03/metodoestrias2.jpg


Tipos básicos de medios de cultivo por consistencia

El tipo de medio de cultivo a utilizar depende del microorganismo de interés y de la necesidad de realizar ese cultivo. Los medios se pueden utilizar para el crecimiento de una especie o para diferenciar entre cepas o especies.

 

Según su consistencia o estado físico pueden ser:

Líquidos o caldos: se emplean fundamentalmente para cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos, estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.

 

Semisólidos Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda.

 

Sólidos o Agares Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. A diferencia de los líquidos se les agrega Agar. El agar es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas, es un elemento solidificante que se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. El agar Se usa a una concentración del 1,5%. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

 

Tipos de medios de cultivo por utilidad práctica:

No selectivos o generales: permiten el cultivo y crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Por ejemplo, Caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar Soya Tripticasa (TSA), Agar marino 2216 o Zobell. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, Factor X, Factor V, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.).

 

Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) permiten el aislamiento y crecimiento del microorganismo o grupo de microorganismos de interés, para lo cual se manipulan factores ya sean de tipo nutricional o de tipo ambiental. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. En el caso de factores nutricionales se añaden al medio sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos, permitiendo a la vez el crecimiento de otros.

 

Los antibióticos, el cloruro sódico en altas concentraciones, colorantes y algunas sustancias químicas son ejemplos de agentes selectivos que se añaden a los medios para inhibir el crecimiento de otros microorganismos diferentes al de interés.El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium.

 

Por ejemplo, los colorantes, que se añaden al Agar, inhiben selectivamente determinados microorganismos, es el caso del verde brillante (Agar verde brillante) utilizado para determinar la presencia de Salmonella en heces fecales ya que inhibe las bacterias Gram positivas, y la mayoría de las bacterias intestinales.

 

Para el caso de factores ambientales se manipula la temperatura, el grado de humedad, el pH, la concentración de oxígeno o la intensidad de la luz. Así el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias. Son ejemplo de este tipo de medios: Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS) para cultivo de Vibrio y Agar Cetrimida para cultivo de Pseudomonas.

 

Enriquecidos: suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de microorganismos, ayudando a su identificación (Lowenstein). En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

 

Diferenciales: permiten distinguir unos microorganismos de otros por las características que presentan las colonias. Se elaboran con base en las características fisiológicas específicas de los microorganismos, por ejemplo, nutrición, respiración entre otras. Algunos medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio de color que se origina cuando éste es metabolizado, como en el caso del medio CLED. Los colorantes que se añaden a estos medios actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido. Un ejemplo es el Rojo Fenol es de color rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. A través del cultivo en medio diferencial se puede distinguir las bacterias que fermentan la lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras. Otros colorantes actúan como inhibidores del crecimiento de unos microorganismos y no de otros, por ejemplo la Violeta de Genciana inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

 

Algunos medios pueden ser a la vez selectivos y diferenciales. El agar Mac Conkey es un ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas (acción selectiva); la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio (acción diferencial). El agar sangre es un agar que contiene hematíes y permite reconocer los microorganismos que producen hemólisis por ejemplo para aislar la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre. Las colonias de esta bacteria producen hemólisis, es decir, muerte y lisis de los hematíes generando una zona transparente a su alrededor. El Agar eosina-azul de metileno (EAM) permite identificar el crecimiento de coliformes y E. coli. Este medio contiene peptona, lactosa y los colorantes eosina y azul de metileno. En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero no el de las coliformes (éstas desarrollan colonias típicas). E. coli muestra colonias grandes, oscuras, negro-azuladas, centro casi negro, con brillo metálico verdoso causado por la luz reflejada. La presencia de coliformes como Enterobacter se manifiesta en colonias grandes, de color rosado pálido, mucosas, con centro oscuro y sin brillo metálico. Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.

 

Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación).




[1]Adaptado de http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioMedios.htm Lic. Eric Caballero